實驗步驟

1. 樣品溶解：

商品開封后，離心機輕甩；隨后加入適量 DMSO 進行溶解，溶解度至少可達 25mg/mL。溶解后建議分裝-20℃避光保存，盡量避免反復凍融，防止吸潮。

【注】：樣品輕甩目的是為了避免痕量的探針吸附管壁損失樣本。

2. 樣品使用：

1) 流式細胞分析：

懸浮細胞：800 g 離心 5 min 收集細胞沉淀；隨后 PBS 洗滌細胞兩遍。

貼壁細胞：棄培養(yǎng)液，用常溫 PBS 或培養(yǎng)液輕洗細胞 2 次，隨后yi酶消化，800g 離心 5 min 收集細胞沉淀，隨后 PBS 洗滌細胞兩遍，每個樣本收集 1~5 ×105 個細胞。(注意：操作過程中輕柔吹打細胞， 消化時間不宜過長，劇烈吹打或yi酶消化過度會影響實驗結果)

本產(chǎn)品 用于脂質過氧化檢測的推薦濃度為終濃度 5μM；配制方法：用新鮮空白培養(yǎng)液配制終濃度為 5μM 的本產(chǎn)品染色液待用，DMSO 含量≤5‰。

(注意：該步操作建議在消化細胞前準備好，以免細胞消化后久置影響實驗結果)

將事先配置好的脂質過氧化染色液加入收集的細胞沉淀中，推薦體積為 500μL，隨后置于 37℃孵箱， 染色 30min，期間 5-10min 間隔輕彈細胞使其懸浮保證染色更充分。

染色結束后，800 g 離心 5 min，棄上清，隨后用PBS 清洗細胞 2 次，加入 200μLPBS 重懸細胞用于流式分析。

2） 原位成像：

接種適當密度的細胞于 20mm 規(guī)格的蓋玻片上（也可用共聚焦小皿替代），給予實驗藥物處理適當時間后，吸去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌細胞一遍加入 500 μL 配制好的脂質過氧化染色液，于 37℃染色 30min；（配制方法參考流式分析中的染色液配制）棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌細胞兩遍后熒光顯微鏡或激光共聚焦下進行成像檢測。細胞在染色后應在 1 h 之內完成檢測。

原位成像實驗范例：

下圖為 RSL3（10 μM）處理A549 細胞 24 h 后，使用本試劑（5μM）對活細胞中脂質過氧化水平進行原位染色后激光共聚焦成像結果。